一、 產品基礎信息描述

本說明書針對的產品為 Qiagen 品牌旗下的經典分子生物學提取試劑盒——DNeasy Blood & Tissue Kit。該產品在國際生物科研領域被廣泛應用于各類動物源性樣本的基因組DNA提取。

•   產品英文全稱：DNeasy Blood & Tissue Kit

•   產品中文譯名：DNeasy 血液與組織DNA提取試劑盒

•   國際貨號 (Cat. No.)：69506

•   品牌歸屬：Qiagen (凱杰)

•   核心規(guī)格：標準版提供50次或250次樣本提取體系 (以250次為例，貨號69506)

•   提取技術：基于硅膠膜離心柱技術 (Silica-Membrane Spin-Column Technology)

•   樣本兼容性：專為動物血液、新鮮/冷凍動物組織、培養(yǎng)細胞、細菌 (革蘭氏陽性/陰性)、昆蟲及毛發(fā)等特殊樣本優(yōu)化

•   下游應用驗證：成功應用于常規(guī)PCR、多重PCR (Multiplex PCR)、熒光定量PCR (qPCR)、數字PCR (dPCR) 以及新一代測序 (NGS)

此試劑盒提供了一種快速、便捷且無需使用酚氯仿等有毒有機試劑的DNA提取方案。其核心優(yōu)勢在于通過蛋白酶K在優(yōu)化的裂解緩沖液中直接裂解樣本，繞過了傳統(tǒng)的機械破碎步驟，極大地縮短了手動操作時間并降低了氣溶膠污染的風險。此外，整個提取流程高度契合Qiagen QIAcube Connect自動化平臺，可實現從樣本裂解到DNA洗脫的全自動化操作，滿足現代實驗室對高通量與標準化的嚴苛需求。

二、 產品核心特點與技術優(yōu)勢

1. 操作簡潔且高度優(yōu)化：對于絕大多數動物組織及血液樣本，該試劑盒僅需加入蛋白酶K與特定緩沖液，在56℃條件下孵育即可完成裂解。這種酶解主導的裂解方式避免了使用勻漿儀或液氮研磨帶來的樣本間交叉污染風險，尤其適合大批量臨床或獸醫(yī)樣本的快速前處理。

2. 廣泛的樣本普適性：無論是高含量的肝臟組織，還是富含膠原蛋白的皮膚、肌腱，亦或是極難裂解的革蘭氏陽性菌和真菌細胞壁，該試劑盒均提供了經過驗證的標準化或補充操作方案，確保從不同生物學材料中均能穩(wěn)定獲取高質量基因組DNA。

3. 抑制劑去除能力：試劑盒內置的專屬緩沖液體系與洗滌步驟，能有效去除樣本中的多糖、蛋白及PCR反應抑制因子。提取出的DNA純度高，無需額外純化步驟即可直接作為模板用于各類下游酶學反應。

4. 靈活的通量適配性：除了常規(guī)的單次樣本離心柱操作，該系列還提供DNeasy 96 Blood & Tissue Kit版本，配合Qiagen 96孔板離心系統(tǒng)，可一次性處理96至192個樣本，契合藥物篩選或群體遺傳學的高通量需求。

5. 環(huán)保升級選項的兼容性：雖然本貨號 (69506) 為標準版，但值得一提的是，Qiagen同期推出了QIAwave DNA Blood & Tissue Kit作為可持續(xù)替代方案。QIAwave版本在保持與本產品全一致的化學成分與提取性能的前提下，大幅減少了塑料與紙板的消耗。這展現了該提取技術體系的成熟與環(huán)保潛力。

三、 工作原理的深度科學解析

DNeasy Blood & Tissue Kit 的核心提取機制建立在高離液鹽 (Chaotropic salts) 存在下的硅膠膜特異性吸附技術之上。這一物理化學過程高效且具選擇性。

1. 細胞裂解與蛋白質消化：在含有高濃度異硫氰酸胍 (Guanidine thiocyanate) 等離液劑的裂解緩沖液中，細胞或細菌壁被迅速破壞，釋放出內部的核酸分子。同時，加入的蛋白酶K (Proteinase K) 在還原劑存在的環(huán)境下，能夠迅速切斷組蛋白與核酸之間的結合，并將大部分蛋白質降解為小肽段或氨基酸。

2. 核酸的選擇性吸附：當溶液中的離液鹽濃度達到臨界值時，水分子會被高濃度的鹽離子所占據（即脫水作用）。此時，呈負電的DNA磷酸骨架暴露出來，與硅膠膜上帶正電荷的官能團發(fā)生強烈的靜電相互作用，從而使DNA被牢固地吸附在離心柱的硅膠膜上。

3. 嚴格的雜質清洗階段：在DNA結合后，通過短暫的離心，含有細胞碎片、多糖、代謝廢物及有機溶劑的廢液被甩入收集管底部。隨后加入的洗滌緩沖液I和II，進一步在高鹽環(huán)境下清除硅膠膜上殘留的蛋白質、脂質及其他細胞代謝物，確保最終的DNA產物純凈無污染。

4. 低鹽環(huán)境下的溫和洗脫：最后一步，使用低鹽或無鹽的洗脫緩沖液 (如Buffer AE或無菌水) 平衡硅膠膜的電荷環(huán)境，中和靜電引力，從而使吸附在膜上的純凈基因組DNA重新溶解在洗脫液中，便于后續(xù)實驗取用。

四、 解決的實驗痛點與實際應用場景

在日常的分子生物學、獸醫(yī)病理學及轉基因動物研究中，科研人員常常面臨諸多棘手的樣本處理難題，而本產品正是為了解決以下核心痛點而設計的：

1. 解決了微量及非標準樣本的提取困境

  在進行大型家畜（如豬、牛）的基因分型或野生動物（如馬匹）的系譜鑒定時，往往只能獲取到極少量的樣本（如一根毛發(fā)、少許干燥血液斑點或微量皮膚活檢組織）。本試劑盒憑借其高靈敏度的載體DNA可選添加方案及高效的微量核酸回收技術，能夠從這些“非標準"樣本中提取出足以為下游基因分型提供可靠數據的基因組DNA。

2. 攻克了高難度樣本的裂解壁壘

  某些特殊樣本（如昆蟲外骨骼、酵母細胞壁、某些頑固的革蘭氏陽性菌）具有極其堅韌的細胞壁結構，常規(guī)的SDS裂解或堿裂解法難以奏效。該試劑盒通過提供特定的補充操作方案（如延長蛋白酶K孵育時間、調整離液鹽濃度），在不依賴昂貴機械破壁設備的前提下，實現了對這些硬核樣本的充分酶解。

3. 消除了復雜樣本中的PCR抑制效應

  在轉基因小鼠的常規(guī)實驗室分析或肉類加工食品的轉基因成分檢測中，樣本常含有大量的血紅素、膠原蛋白、多糖或食品防腐劑，這些物質會嚴重抑制Taq DNA聚合酶的活性。本試劑盒的多步洗滌緩沖液系統(tǒng)能針對性地去除這些抑制因子，提取出的DNA即使在多重熒光定量PCR中也能展現出佳的反應曲線。

4. 滿足了食品安全與成分鑒定的合規(guī)需求

  針對植物性食品（如大豆、豆腐、餅干）或深加工肉制品（如香腸、巧克力），該試劑盒可與Qiagen其他專用試劑盒互補，為食品中的外源基因（如Roundup Ready Soybean和MON810 Maize）檢測提供合格的模板DNA，助力食品安全的合規(guī)篩查。

五、 詳細實驗操作流程 (以標準動物血液/組織為例)

為了確保每一次提取都能獲得穩(wěn)定、高質量的DNA，請務必嚴格按照以下步驟進行操作。實驗前，請確保所有緩沖液已達到室溫，并在Buffer AW1和AW2中加入指定體積的乙醇。

第一步：樣本的預處理與裂解

•   動物組織：取25-30 mg新鮮或冷凍的組織塊。為避免DNA剪切，請勿使用高速勻漿機。直接將組織塊放入1.5 ml離心管中，加入180 µl Buffer ATL和20 µl Proteinase K (10 mg/ml)，渦旋混勻。

•   動物全血：取20-100 µl抗凝血，加入180 µl Buffer ATL和20 µl Proteinase K，充分混勻。

•   孵育裂解：將離心管置于56℃水浴箱中孵育。對于軟組織（如肝臟、脾臟），通常1-3小時即可全消化；對于硬組織（如皮膚、肌肉）或血液中白細胞沉淀，建議延長孵育時間至 overnight（過夜），期間可輕輕振蕩混勻以加速裂解。

第二步：調整結合條件與上柱

•   裂解全后，短暫離心將管蓋上的液滴甩下。加入200 µl Buffer AL，渦旋15秒使其與裂解液充分混合。此時溶液應變得清亮。

•   加入200 µl無水乙醇 (Ethanol)，再次渦旋混勻。此時可能會出現白色沉淀，屬正?，F象。

•   將DNeasy Mini離心柱放入收集管中，將樣本-緩沖液混合液全部轉移至離心柱內（若體積過大，可分兩次轉移）。

•   12000 rpm (~13400 x g) 離心1分鐘。將流出液倒入廢液缸，再將離心柱放回收集管。

第三步：雜質洗滌與去除

•   向離心柱內加入500 µl Buffer AW1。12000 rpm 離心1分鐘，棄去收集管底部的廢液。

•   向離心柱內加入500 µl Buffer AW2。13000 rpm (~17900 x g) 離心3分鐘，這一步的目的是去除殘留的乙醇和鹽離子。

•   關鍵提示：為防止乙醇殘留影響后續(xù)酶切或PCR反應，建議將離心柱開蓋，在室溫下靜置5-10分鐘，使硅膠膜全干燥。

第四步：DNA的洗脫與保存

•   將離心柱轉移至一個新的1.5 ml干凈離心管中。

•   向硅膠膜中央懸空滴加50-200 µl 預熱至55℃的Buffer AE或無菌蒸餾水。室溫靜置1-5分鐘，讓DNA充分溶解。

•   12000 rpm 離心1分鐘，管底即為提取完成的基因組DNA。

•   提取的DNA可立即用于下游實驗，或于-20℃/-80℃長期保存。

六、 針對不同樣本類型的專項優(yōu)化建議

為了幫助您應對更復雜的實驗材料，以下是基于大量實驗數據總結的特殊樣本處理建議：

1. 細菌樣本 (革蘭氏陽性/陰性菌)

  在處理細菌時，預期得率約為每2x10^9個細胞提取10 µg基因組DNA。由于細菌細胞壁的堅韌程度差異巨大，對于革蘭氏陽性菌（如葡萄球菌、鏈球菌），建議在Buffer ATL中加入蛋白酶K后，適當提高孵育溫度至70℃并延長消化時間；或者在56℃過夜孵育后，補加一次蛋白酶K繼續(xù)消化，這能顯著提升破壁效率及最終的DNA得率。

2. 酵母與真菌樣本

  酵母細胞壁含有大量幾丁質和葡聚糖，常規(guī)蛋白酶K難以快速穿透。針對此類樣本，請務必參照本產品專門的補充操作方案《Purification of total DNA from yeast using the DNeasy Blood & Tissue Kit》(DY13)。通常需要預先使用機械力（如玻璃珠震蕩破碎）或加入特定的破壁酶（如Lyticase）進行預處理，然后再銜接標準的DNeasy提取流程。

3. 昆蟲樣本

  昆蟲的硬殼和外骨骼極易在提取過程中引入大量的幾丁質和黑色素，這些物質具有強烈的PCR抑制效應。請遵循專門的補充方案《Purification of total DNA from insects using the DNeasy Blood & Tissue Kit》(DY14)。在裂解階段，增加蛋白酶K的用量并延長孵育時間至過夜是確保充分消化的關鍵。同時，在洗滌步驟中確保Buffer AW2去除殘留的雜質。

4. 微量與痕量樣本 (如單根毛發(fā)、唾液、粗提裂解液)

  當處理預期DNA含量低于10 ng的微量樣本時，強烈建議在裂解或結合步驟中加入載體DNA（如poly-dA、poly-dT或鯡魚精DNA），其終濃度應不低于10 µg/ml。這能為微量核酸提供結合位點，防止其在純化過程中因吸附損耗而丟失。但需注意，若后續(xù)實驗涉及寡核苷酸引物（如oligo-dT）的使用，則不能使用poly-dA作為載體，以免引發(fā)非特異性結合干擾實驗結果。

5. 植物細胞與食品基質

  雖然本試劑盒主要針對動物樣本優(yōu)化，但在處理轉基因大豆、玉米或深加工食品（如巧克力、香腸）時同樣表現優(yōu)異。對于富含多糖的植物組織，可參考《Purification of total DNA from crude lysates using the DNeasy Blood & Tissue Kit》(DY15) 方案，即先使用SDS或CTAB法自行裂解植物樣本，去除多糖和次生代謝物后，取上清液接入DNeasy流程進行硅膠膜純化。

七、 下游應用表現與核酸質控標準

提取的基因組DNA質量直接決定了后續(xù)分子生物學實驗的成敗。使用DNeasy Blood & Tissue Kit提取的DNA，在各項下游應用中均展現出高度的可靠性：

1. PCR與多重PCR應用

  提取的DNA不含血紅素或其他蛋白酶抑制劑，能夠作為理想的模板用于標準PCR擴增。在需要同時擴增多個位點的高效16重PCR體系中，使用該試劑盒提取的模板依然能夠支持所有靶點呈現出均勻、清晰的擴增條帶，無明顯的偏好性或抑制現象。

2. 熒光定量PCR (qPCR) 與數字PCR (dPCR)

  在需要高靈敏度和精準定量的應用中（如轉基因小鼠的拷貝數分析、病原載量測定），DNA的純度至關重要。該試劑盒提取的DNA在qPCR中展現出極低的Ct值背景噪音和擴增效率曲線。同時，其也全兼容高靈敏度的dPCR和NGS建庫需求。

3. 濃度測定與質控建議

  •   光譜光度法：使用NanoDrop等分光光度計檢測時，純的基因組DNA在260 nm處有吸收峰，A260/A280比值應在1.8-2.0之間，A260/A230應大于2.0。

  •   熒光定量法：對于低濃度樣本（如毛發(fā)或微量血），分光光度計往往無法給出準確數值。此時，推薦使用PicoGreen等DNA特異性熒光染料進行定量，該方法靈敏度高，可準確測定pg級別的核酸。

  •   完整性檢測：通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，完整的基因組DNA應呈現一條位于膠孔附近的高分子量條帶。若發(fā)生降解，會出現拖尾現象。

八、 常見問題排查與解決方案 (Troubleshooting)

在實驗過程中遇到問題時，請參考以下排查指南進行優(yōu)化：

1.如果遇到 DNA 得率極低或無 DNA 的情況，可能的原因包括樣本未充分裂解、乙醇忘記加入 Buffer AW1/AW2 導致結合失敗、洗脫體積過小或 pH 值不當、以及微量樣本未發(fā)生載體 DNA 沉淀。對應的解決方案為：延長蛋白酶 K 孵育時間，或提前液氮研磨以增加接觸面積；檢查洗滌緩沖液配制過程，確保加入了正確體積的乙醇；使用 pH 7.5-8.0 的 Buffer AE 洗脫，可適當加熱至 55℃ 以促進溶解；在微量樣本中加入 poly-dA 等載體 DNA 輔助沉淀。

2.如果 DNA 純度差，導致 PCR 無擴增，這通常是因為洗滌不充分導致蛋白酶 K 殘留，或者乙醇殘留抑制了 Taq 酶活性，也可能是樣本本身含有多糖或色素抑制劑。建議嚴格按規(guī)程加入 Buffer AW1 和 AW2，并執(zhí)行高轉速離心；增加一次無水乙醇洗滌步驟，或延長離心柱干燥時間；針對特殊樣本參考補充方案，必要時增加苯酚/氯仿抽提前處理步驟。

3.如果 DNA 在洗脫液中不溶解或呈粘稠狀，可能是因為洗脫緩沖液體積過少，或者基因組 DNA 分子量過大發(fā)生剪切困難。建議增加洗脫緩沖液體積至 100-200 µl。洗脫時置于 55℃ 水浴 1-2 小時并輕柔搖晃，切勿劇烈震蕩，以免造成 DNA 斷裂。

4.如果 A260/A230 比值過低（小于 1.8），表明離液鹽或乙醇未洗凈，或者樣本中含有較多多糖或蛋白雜質。應嚴格執(zhí)行 Buffer AW2 的高轉速 (13000 rpm) 離心步驟；樣本裂解后，可先 8000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液進行過柱操作，以去除不溶性雜質。

九、 試劑組分、儲存條件與實驗室安全規(guī)范

1. 試劑盒組成 (以50次規(guī)格為例)

  貨號69506試劑盒通常包含：DNeasy Mini離心柱 (50個)、2 ml收集管 (50個)、Buffer ATL (50 ml)、Buffer AL (50 ml)、Buffer AW1 (15 ml，使用前按指示加乙醇)、Buffer AW2 (18 ml，使用前按指示加乙醇)、Buffer AE (15 ml)、蛋白酶K (10 mg/ml, 1.5 ml)。

2. 儲存與保質期

  •   蛋白酶K (Proteinase K)：收貨后可室溫穩(wěn)定保存1年。為延長其活性壽命，建議儲存于2-8℃。

  •   其他緩沖液 (Buffer ATL, AL, AW1, AW2, AE)：室溫 (15-25℃) 密封儲存。一旦開啟，建議在1年內使用完畢以保證最佳效果。

  •   DNeasy Mini離心柱：室溫干燥避光保存。

3. 廢液處理與實驗室安全

  •   本試劑盒中的裂解液和結合緩沖液含有異硫氰酸胍等離液鹽成分，具有一定的生物滅活能力，可降解部分有害生物材料。

  •   所有接觸過生物樣本的廢液（特別是含有離液鹽和蛋白酶K的廢液）絕對不能直接與漂白劑或酸性溶液混合，否則會產生劇毒的氣體。

  •   實驗過程中產生的固體廢物（如Tip頭、離心管），以及未處理完的生物樣本殘渣，必須根據您所在機構的生物危害廢物處置指南進行分類和高壓滅菌處理。

  •   操作全程請穿戴實驗服、佩戴防護手套和護目鏡，在通風櫥內處理揮發(fā)性試劑。

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（注：本文內容基于品牌公開資料及行業(yè)常規(guī)信息整理，具體以品牌信息文檔為準。）

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