一、 產(chǎn)品描述

在分子生物學(xué)、基因表達(dá)分析以及高通量測序等前沿生命科學(xué)領(lǐng)域，高純度、完整性好的總RNA（Total RNA）的提取是后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功的基石。QIAGEN RNeasy Mini Kit 作為全球科研人員廣泛認(rèn)可和信賴的RNA提取金標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品，為廣大用戶提供了一種快速、便捷且具重復(fù)性的總RNA純化方案。

本說明書旨在為用戶提供關(guān)于該產(chǎn)品深層次的解析，從基礎(chǔ)的產(chǎn)品信息到深奧的工作原理，再到實(shí)際操作中可能遇到的各類疑難雜癥的解決方案，力求做到詳盡、客觀、真實(shí)，以助您輕松駕馭各類RNA提取實(shí)驗(yàn)。

核心產(chǎn)品信息：

• 品牌（Brand）： QIAGEN（德國凱杰）

• 英文名（English Name）： RNeasy Mini Kit

• 中文名（Chinese Name）： RNeasy Mini 離心柱式總RNA提取試劑盒

• 貨號（Catalog Number）： 74104

• 規(guī)格（Pack Size）： 50次制備（50 Preps）

• 主要應(yīng)用（Application）： 適用于從動物細(xì)胞、人或動物組織、酵母等各類生物樣本中快速分離純化高質(zhì)量的總RNA。

• 核心技術(shù)（Technology）： 基于硅膠膜選擇性吸附的離心柱純化技術(shù)（Spin Column Technology）。

• 下游應(yīng)用兼容性： 純化的RNA可直接用于RNA測序（RNA-Seq）、實(shí)時定量PCR（qRT-PCR）、終點(diǎn)法RT-PCR、Northern Blot、基因芯片（Microarray）分析以及體外翻譯等各類敏感型下游實(shí)驗(yàn)。

二、 產(chǎn)品特點(diǎn)與優(yōu)勢

QIAGEN RNeasy Mini Kit 之所以能在眾多RNA提取試劑中脫穎而出，得益于其精妙的設(shè)計(jì)和性能表現(xiàn)。其主要特點(diǎn)包括：

1. 極速高效的提取流程： 整個RNA純化過程僅需約20至30分鐘，極大地縮短了實(shí)驗(yàn)周期，相比傳統(tǒng)的抽提法效率提升數(shù)倍。

2. RNA純度與產(chǎn)量： 采用高鹽結(jié)合、低鹽洗脫的原理，配合精心優(yōu)化的洗滌緩沖液，能夠有效去除蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)以及其他大分子污染物。從不同量的起始材料中均能獲得具有高A260/A280比值（通常在1.9至2.1之間）的純凈RNA。

3. 廣泛的樣本兼容性： 無論是疏松的哺乳動物細(xì)胞，還是致密的肝臟、脾臟組織，甚至是較難處理的酵母菌株，該試劑盒均能提供穩(wěn)定可靠的提取結(jié)果。對于珍貴稀少的樣本，甚至可兼容低至單個細(xì)胞的起始量。

4. 告別有毒有機(jī)溶劑： 傳統(tǒng)的RNA提取方法（如TRIzol法）需要使用苯酚、氯仿等劇毒且易揮發(fā)的有機(jī)溶劑，不僅危害實(shí)驗(yàn)人員健康，還易造成環(huán)境污染。RNeasy Mini Kit 全摒棄了這些危險試劑，提供了一個安全、無毒的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

5. 靈活的通量選擇： 除了手動離心操作外，該體系還可與QIAcube自動化工作站對接，實(shí)現(xiàn)1至12個樣本的自動化純化；同時，其底層化學(xué)原理也支持向96孔板高通量格式的平滑過渡。

6. 可整合柱上DNase消化： 對于痕量DNA殘留極其敏感的下游應(yīng)用（如單細(xì)胞測序或高靈敏度qPCR），該試劑盒可與RNase-Free DNase Set聯(lián)用，在離心柱上直接進(jìn)行DNase酶切反應(yīng)，消除基因組DNA的干擾。

三、 工作原理詳解

QIAGEN RNeasy Mini Kit 的核心技術(shù)在于其硅膠膜（Silica-Gel Membrane）純化技術(shù)，這一技術(shù)的成功應(yīng)用建立在嚴(yán)密的生物化學(xué)平衡之上。其具體工作機(jī)制可以分為以下四個關(guān)鍵階段：

1. 強(qiáng)力裂解與RNase瞬間失活

試劑盒提供的裂解液Buffer RLT含有高濃度的異硫氰酸胍（Guanidine thiocyanate）和β-巰基乙醇（β-Mercaptoethanol）。異硫氰酸胍是一種強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，能夠迅速破壞細(xì)胞膜和核膜，使核酸釋放到溶液中。與此同時，β-巰基乙醇作為一種還原劑，能夠斷裂RNase分子中的二硫鍵，導(dǎo)致RNase酶失活。這種雙重保障機(jī)制確保了釋放出的RNA不會在提取初期就被降解。

2. 鹽誘導(dǎo)下的特異性吸附

在裂解并勻質(zhì)化樣本后，向裂解液中加入一定比例的乙醇（通常為70%或95%乙醇，視具體樣本而定）。在高濃度鹽離子（如鹽酸胍）和醇類溶劑的共同作用下，RNA分子上的磷酸骨架與硅膠膜表面的硅醇基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的脫水作用。這種脫水作用破壞了RNA在水相中的溶解度，促使RNA分子以其磷酸骨架通過氫鍵和靜電引力特異性地吸附在硅膠膜上。而蛋白質(zhì)、多糖、代謝物以及DNA等雜質(zhì)則因?yàn)闊o法形成這種脫水結(jié)構(gòu)，隨濾液被去除。

3. 嚴(yán)格的階段性洗滌

為了保證最終產(chǎn)物的純度，吸附了RNA的硅膠膜需要經(jīng)過兩步嚴(yán)格的洗滌過程。第一步使用Buffer RW1，這是一種低濃度鹽緩沖液，主要用于去除殘存的蛋白質(zhì)和其他水溶性雜質(zhì)。第二步使用Buffer RPE，這是一種含有乙醇的洗滌緩沖液，其核心目的是去除痕量的鹽分以及前面步驟中可能殘留的有機(jī)溶劑。每一步洗滌后都需要進(jìn)行高轉(zhuǎn)速的空柱離心，以去除膜上殘留的洗滌液，防止酒精等揮發(fā)性物質(zhì)影響后續(xù)的洗脫效率和RNA的純度指標(biāo)。

4. 低鹽環(huán)境下的高效洗脫

經(jīng)過充分洗滌并短暫晾干的硅膠膜，其上的RNA處于一種緊密結(jié)合但可逆的狀態(tài)。此時，加入無RNase的水（RNase-free water）或10 mM Tris-Cl (pH 7.5)。由于洗脫液的鹽濃度極低，且水相環(huán)境恢復(fù)了RNA的溶解性，RNA分子迅速脫離硅膠膜表面，重新溶解于洗脫液中。通過適當(dāng)?shù)姆跤龝r間和離心力，即可回收高濃度的純凈總RNA。

四、 解決實(shí)驗(yàn)中的哪些痛點(diǎn)與難題

在科研實(shí)驗(yàn)中，選擇一款合適的提取試劑往往決定了實(shí)驗(yàn)的成敗。QIAGEN RNeasy Mini Kit 針對性地解決了科研人員在傳統(tǒng)RNA提取過程中面臨的諸多棘手問題：

• 除了RNA降解的隱患： 傳統(tǒng)酚氯仿抽提法操作繁瑣、耗時較長，樣本在操作中暴露于常溫環(huán)境過久極易導(dǎo)致RNA被內(nèi)源性或外源性RNase降解。本試劑盒通過“秒級"裂解鎖存機(jī)制和全程低溫/快速操作指導(dǎo)，將RNA降解的風(fēng)險降至很低。

• 有效規(guī)避了有機(jī)溶劑的毒性危害： 酚和氯仿不僅具有強(qiáng)烈的腐蝕性，其揮發(fā)氣體還會對實(shí)驗(yàn)人員的呼吸道和皮膚造成嚴(yán)重傷害。本試劑盒全程無需接觸此類危險品，提升了實(shí)驗(yàn)室的安全系數(shù)。

• 攻克了微量樣本提取效率低下的難關(guān)： 在激光捕獲顯微切割（LCM）或流式細(xì)胞術(shù)（FACS）分選實(shí)驗(yàn)中，研究人員往往只能獲得極少量的細(xì)胞。傳統(tǒng)沉淀法在處理微量樣本時損耗極大，而得率極低。本試劑盒的微型離心柱和特異性結(jié)合條件，能夠高效捕獲低至皮克（pg）級別的RNA，哪怕是單個人類細(xì)胞也能順利提取出可用于qPCR的RNA量。

• 消除了痕量DNA污染的干擾： 在基因表達(dá)定量分析中，微量的基因組DNA污染會導(dǎo)致Ct值提前，造成假陽性或定量偏高。本試劑盒不僅通過優(yōu)化的鹽濃度抑制了DNA的結(jié)合，還提供了成熟的 On-column DNase 消化方案，確保獲得的RNA絕對純凈。

• 擺脫了昂貴精密儀器的束縛： 不同于需要昂貴磁棒法自動提取儀或笨重的真空 manifolds，本試劑盒僅需一臺常規(guī)臺式離心機(jī)即可完成全部操作，極大地降低了設(shè)備門檻和運(yùn)行維護(hù)成本。

五、 儲存條件與試劑準(zhǔn)備

為了保證試劑盒各組分的穩(wěn)定性和最佳性能，正確的儲存至關(guān)重要。

1. 儲存條件：

• 未開封試劑盒： 應(yīng)于室溫（15-25℃）干燥避光保存。在此條件下，所有組分在包裝標(biāo)示的有效期內(nèi)均保持穩(wěn)定。

• 開封后儲存：

 • RNeasy Mini離心柱（Spin Columns）： 含有硅膠膜，極易受潮。使用后應(yīng)立即蓋緊管蓋，室溫保存。

 • Buffer RLT（裂解液）： 含有異硫氰酸胍，室溫保存。若出現(xiàn)結(jié)晶，可于37℃水浴助溶。

 • Buffer RW1 與 Buffer RPE（洗滌液）： 室溫保存。

 • RNase-free water（洗脫液）： 室溫保存。

• 工作液配制及穩(wěn)定性：

 • Buffer RPE 濃縮液： 使用前必須按瓶身標(biāo)簽指示加入指定體積的無水乙醇（Ethanol）。配制后的Buffer RPE可在室溫下穩(wěn)定保存至少1年。

 • Buffer RW1 濃縮液： 某些批次的Buffer RW1在出廠時為濃縮狀態(tài)，需按標(biāo)簽指示稀釋后使用。稀釋后室溫保存。

 • β-巰基乙醇（β-ME）添加： 使用前必須向Buffer RLT中加入β-巰基乙醇（終濃度為1%）。注意：含β-ME的Buffer RLT在室溫下可穩(wěn)定保存1個月；若分裝后置于-20℃，則可保存更久。

2. 耗材準(zhǔn)備：

實(shí)驗(yàn)過程中務(wù)必使用無RNase的離心管和吸頭。所有涉及RNA操作的臺面、移液器及實(shí)驗(yàn)服均需保持清潔，建議配備專用的RNA操作移液器。

六、 詳盡使用方法與實(shí)驗(yàn)操作指南

以下為使用 QIAGEN RNeasy Mini Kit (貨號 74104) 進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞或組織總RNA提取的標(biāo)準(zhǔn)操作流程。整個流程需在15-25℃環(huán)境下進(jìn)行。

第一階段：實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作

1. 配制Buffer RLT工作液： 取出Buffer RLT，根據(jù)單次實(shí)驗(yàn)所需用量，按1%的體積比加入β-巰基乙醇（例如：1 mL Buffer RLT加入10 μL β-ME）。混勻后室溫放置。

2. 稀釋洗滌液： 確認(rèn)Buffer RW1（如需稀釋）和Buffer RPE已按說明書要求加入適量無水乙醇。使用前在瓶身做好標(biāo)記。

3. 準(zhǔn)備無RNase水： 將RNase-free water預(yù)熱至55-60℃，這有助于提高RNA的洗脫效率。

4. 樣本預(yù)處理：

  • 貼壁細(xì)胞： 吸除培養(yǎng)液，直接用PBS洗滌一次。然后直接向培養(yǎng)皿中加入適量Buffer RLT，反復(fù)吹打使細(xì)胞全裂解。

  • 懸浮細(xì)胞： 收集細(xì)胞至離心管，棄上清，加入Buffer RLT重懸沉淀。

  • 組織樣本： 稱取10-30 mg新鮮或RNAprotect保存的組織，放入含有Buffer RLT的離心管中，使用TissueRuptor II等勻漿器勻質(zhì)化至無肉眼可見顆粒。

第二階段：RNA的結(jié)合與洗滌

5. 調(diào)節(jié)結(jié)合條件： 向勻漿液或裂解液中加入等體積的70%乙醇（例如：600 μL裂解液加600 μL 70%乙醇），立即上下顛倒混勻。此時可能會形成半透明沉淀，屬正?，F(xiàn)象。

6. 上柱吸附： 將RNeasy Mini離心柱放入2 mL收集管中。將樣本-乙醇混合液（約650 μL）轉(zhuǎn)移至離心柱內(nèi)，蓋上管蓋，10,000 × g 離心15秒。將流出液棄去。

7. 重復(fù)上樣： 將剩余混合液加入離心柱，再次10,000 × g 離心15秒，棄廢液。

8. 第一次洗滌（Buffer RW1）： 向離心柱中加入350 μL Buffer RW1，蓋上管蓋，10,000 × g 離心15秒，棄廢液。

9. 第二次洗滌（Buffer RPE）： 向離心柱中加入500 μL Buffer RPE，蓋上管蓋，10,000 × g 離心15秒，棄廢液。

10. 空柱干燥： 將離心柱重新放回收集管，最大轉(zhuǎn)速（≥13,000 × g）離心2分鐘。此步驟至關(guān)重要，能去除膜上殘留的乙醇，防止其影響下游酶促反應(yīng)。

第三階段：RNA的洗脫

11. 轉(zhuǎn)移離心柱： 將RNeasy Mini離心柱移至一個新的1.5 mL無RNase離心管中。

12. 加入洗脫液： 向硅膠膜中央加入30-50 μL預(yù)熱的無RNase水。室溫靜置1-5分鐘，讓RNA充分溶解。

13. 離心收集： 10,000 × g 離心1分鐘，管底即為純化好的總RNA。

14. 濃度測定與保存： 取1-2 μL洗脫的RNA使用分光光度計(jì)（如Nanodrop）測定濃度和純度。剩余RNA可分裝后保存于-70℃至-80℃，避免反復(fù)凍融。

(注：若需進(jìn)行柱上DNase消化，需在第一步洗滌Buffer RW1之后，加入配制好的DNase I反應(yīng)液，室溫孵育15分鐘，然后再繼續(xù)進(jìn)行Buffer RPE洗滌步驟。)

七、 常見問題與深度解決方案（FAQ）

在實(shí)際操作過程中，即便遵循標(biāo)準(zhǔn)流程，實(shí)驗(yàn)人員也可能遇到各種突發(fā)狀況。以下是針對本產(chǎn)品的常見疑難問題及其背后的原因剖析與解決對策：

1. 提取出的RNA中含有基因組DNA（gDNA）污染，導(dǎo)致qPCR出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增或熔解曲線異常。

原因分析：

• 起始樣本量過大，超出了硅膠膜的吸附容量，導(dǎo)致部分DNA非特異性結(jié)合。

• 加入乙醇后未充分混勻，導(dǎo)致局部鹽分過高，引起DNA共同沉淀。

• 樣本本身富含DNA（如脾臟、胸腺等），常規(guī)洗滌難以全去除。

解決方案：

• 優(yōu)化樣本量： 嚴(yán)格控制在推薦范圍內(nèi)（如細(xì)胞不超過1×10^7，組織不超過30 mg）。

• 強(qiáng)化混勻步驟： 在加入70%乙醇后，務(wù)必立即劇烈上下顛倒混合，確保溶液均一。

• 啟用DNase消化： 強(qiáng)烈建議增加On-column DNase I處理步驟。具體操作是在Buffer RW1洗滌后，向柱子中加入50 μL DNase I 工作液（含5 μL DNase I 原液和45 μL Buffer RDD），室溫靜置15分鐘，然后再用Buffer RW1清洗一次以終止反應(yīng)。

2. RNA得率極低，遠(yuǎn)低于預(yù)期值。

原因分析：

• 樣本未能充分裂解或勻質(zhì)化，導(dǎo)致RNA未被全釋放。

• 洗脫步驟操作不當(dāng)，RNA未全從膜上洗脫下來。

• 樣本保存不當(dāng)，RNA在提取前已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重降解，導(dǎo)致小分子片段在洗滌步驟中被洗掉。

解決方案：

• 加強(qiáng)勻漿力度： 對于纖維豐富的組織（如心臟、骨骼?。?，需延長勻漿時間或使用更鋒利的研磨頭；對于細(xì)胞團(tuán)塊，需先將其打散。

• 優(yōu)化洗脫條件： 使用預(yù)熱至55℃的無RNase水進(jìn)行洗脫，并在加入水后室溫孵育2-5分鐘，以增加RNA的溶解度。若洗脫得率不高，可將洗脫液再次上柱，進(jìn)行二次洗脫。

• 規(guī)范樣本保存： 新鮮樣本應(yīng)盡快提??；若無法立即提取，應(yīng)迅速冷凍于液氮中，或浸泡于RNAprotect Tissue Reagent中室溫保存。

3. RNA發(fā)生明顯降解，瓊脂糖凝膠電泳中28S和18S核糖體RNA條帶模糊或呈彌散狀。

原因分析：

• 實(shí)驗(yàn)環(huán)境中存在外源性RNase污染（如移液器、槍頭、離心管或?qū)嶒?yàn)臺面）。

• 裂解液Buffer RLT中未添加β-巰基乙醇，或添加后存放過久失效。

• 樣本解凍過程緩慢，在未全融化前RNase即開始復(fù)蘇并降解RNA。

解決方案：

• 建立無RNase環(huán)境： 實(shí)驗(yàn)前用RNase清除劑擦拭臺面和移液器。更換新的無RNase槍頭和離心管。操作時始終佩戴一次性手套。

• 檢查裂解液狀態(tài)： 確保Buffer RLT中已按比例添加β-巰基乙醇，且現(xiàn)配現(xiàn)用（室溫下一個月內(nèi)使用完畢）。

• 快速解凍樣本： 將凍存樣本從-80℃取出后，立即投入液氮預(yù)冷，或在冰上迅速操作，縮短其在RNase活躍溫度（如37℃）下的暴露時間。

4. A260/A280 比值偏低（小于1.8），提示存在蛋白質(zhì)或其他有機(jī)溶劑污染。

原因分析：

• Buffer RPE中含有乙醇，若最后一次離心后未將離心柱管壁晾干，殘留的乙醇會混入洗脫液中，吸收230 nm和280 nm處的紫外線。

• 洗滌步驟中Buffer RW1或Buffer RPE的用量不足，未能洗凈硅膠膜上的雜質(zhì)。

解決方案：

• 增加空柱離心時間： 在最后一次洗滌（Buffer RPE）并離心后，務(wù)必將離心柱重新插入收集管，以最大轉(zhuǎn)速（≥13,000 × g）額外離心2分鐘。確保管蓋和管底邊緣無任何液體殘留。

• 確保洗滌液覆蓋全膜： 加入洗滌液時，應(yīng)盡量將液體加在硅膠膜的中央，并觀察液面是否全覆蓋了膜的表面。可適當(dāng)增加洗滌液的體積（如RW1加至400 μL，RPE加至600 μL）。

5. A260/A230 比值異常（通常低于2.0甚至更低）。

原因分析：

• 這是RNA提取中最常見的純度問題之一。A260/A230偏低意味著樣本中存在鹽離子（如鹽酸胍）、EDTA或多糖等污染物的殘留。

• 通常是因?yàn)樽詈笠淮蜗礈觳襟E不夠充分，導(dǎo)致硅膠膜上殘留了高濃度的鹽離子。

解決方案：

• 增加RPE洗滌次數(shù)： 在標(biāo)準(zhǔn)的操作流程中增加一次Buffer RPE的洗滌（即總共洗滌兩次），每次洗滌后均需充分空柱離心去乙醇。

• 檢查乙醇添加量： 確認(rèn)在配制Buffer RPE時加入了足量的無水乙醇。如果乙醇濃度過低，將無法有效去除鹽分。

6. 洗脫體積小，但測得的RNA濃度依然很低。

原因分析：

• 洗脫液未全覆蓋硅膠膜，導(dǎo)致部分RNA仍干結(jié)在膜上。

• 使用的洗脫液體積過?。ㄈ绲陀?0 μL），不足以將膜上的RNA全溶解帶下。

解決方案：

• 控制洗脫體積： 建議洗脫體積設(shè)定在30-50 μL之間。體積過小易導(dǎo)致粘度過大，RNA難以全溶解；體積過大則會稀釋RNA濃度。

• 延長孵育時間： 加入洗脫液后，不要立即離心，而是在室溫下靜置3-5分鐘，讓水充分滲透硅膠膜，溶解RNA。

• 分步洗脫法： 若樣本極其珍貴且初始體積大，可采用兩次洗脫法。第一次加入30 μL水，離心收集；第二次再加入30 μL水，再次離心收集于同一管內(nèi)。

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