cosmobiousa高質(zhì)量抗人類四跨膜蛋白單克隆

用抗人類四跨膜蛋白單克隆抗體和OptiPrep™進(jìn)行外顯子的

分離和鑒定

什么是外泌體？

細(xì)胞外囊泡（EV；包括經(jīng)典的外泌體，非經(jīng)典的外泌體，微囊泡，大的脂質(zhì)體，凋亡小體，凋亡小泡，自噬性細(xì)胞外小泡，兩性小體和ARRM）是釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的40-1000 nm的膜小泡。和來(lái)自大多數(shù)細(xì)胞類型的體液，包括紅細(xì)胞，血小板，淋巴細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。這些囊泡根據(jù)其分泌機(jī)制分為兩種。因此，經(jīng)典囊泡在多囊泡內(nèi)體中形成，而微囊泡則是從質(zhì)膜上直接出芽而形成的。盡管經(jīng)典外泌體成分因其起源的細(xì)胞類型而異，但無(wú)論它們的起源如何，似乎都可能共享某些分子。這些分子包括四跨膜蛋白（CD9，CD63和CD81），它們被認(rèn)為是經(jīng)典外泌體生物發(fā)生機(jī)制的重要組成部分。因此，研究人員已使用CD9，CD63和CD81來(lái)分離和表征經(jīng)典外泌體制劑的純度。

在過(guò)去的十年中，外泌體作為microRNA（miRNA）載體，疾病生物標(biāo)志物和潛在的治療性藥物傳遞載體成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。盡管外泌體很重要，但它們的分離和鑒定仍然被認(rèn)為是重大的科學(xué)挑戰(zhàn)，特別是在轉(zhuǎn)化為臨床需求時(shí)。通常，外泌體和其他電動(dòng)汽車已通過(guò)超速離心純化。技術(shù)挑戰(zhàn)，時(shí)間和成本已導(dǎo)致替代提純方法的泛濫，其中許多現(xiàn)在可商購(gòu)獲得。雖然據(jù)報(bào)道外泌體含量包括基因組DNA，RNA，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)， 

近的地標(biāo)性論文（杰普森·D。，菲尼克斯·A。，富蘭克林·J。希金博特姆·J。，張Q.，齊默曼·L。利勃勒·D。，平·J。，劉Q. Evans，R.，F(xiàn)issell，W.，Patton，J.，Rome，L.，Burnette，D.，Coffey，R.（2019）。外泌體組成細(xì)胞的重新評(píng)估177（2），428-445.e18。）結(jié)果表明，大多數(shù)外泌體分離方法（包括經(jīng)典的超速離心分離法）都受到來(lái)自非囊泡細(xì)胞外來(lái)源的大量蛋白質(zhì)和DNA污染的困擾。揭示這種令人驚訝的污染水平的方法包括高分辨率碘克沙醇密度梯度超速離心[將小型EV與非囊泡成分（如穹ault和外泌體）分離）以及使用抗體從人血漿和細(xì)胞條件培養(yǎng)基中直接免疫捕獲（DIC）至四跨膜蛋白分子CD63，CD9或CD81。

  高質(zhì)量抗人類四跨膜蛋白單克隆

冷凍電子顯微鏡檢測(cè)與抗人CD63抗體結(jié)合的外泌體（克隆8A12）。
將外泌體和抗人CD63抗體（克隆8A12）混合并用冷凍電子顯微鏡（Titan Krios）成像。顯示的是外泌體（A）的低溫電子顯微照片，利用單結(jié)合抗體（青色）對(duì)外泌體（綠色）進(jìn)行的三維重建（B），以及外泌體和結(jié)合抗體的旋轉(zhuǎn)3D層析成像重建（宜）。圖片由沖繩蛋白質(zhì)斷層掃描有限公司提供。 

來(lái)自CosmoBio USA的高特異性抗人四跨膜蛋白抗體是使用新型“超凈”方法表征和分離經(jīng)典外泌體的理想試劑。

* Tide Fluor™2（TF2）的光譜特性與熒光素和AlexaFluor®488（Invitrogen）相似。與熒光素相比，TF2具有更強(qiáng)的熒光和更高的光穩(wěn)定性。另外，它的熒光在pH 3到11之間與pH無(wú)關(guān)。與FITC標(biāo)記的抗體相比，TF2標(biāo)記的抗體顯示出更強(qiáng)的熒光和更高的光穩(wěn)定性。這些特性使TF2成為熒光素的替代品。 
＃Tide Fluor™5（TF5）具有與Cy5相同的光譜特性。與Cy5相比，TF5具有更強(qiáng)的熒光性和更高的光穩(wěn)定性。此外，其熒光在pH 3至11之間與pH無(wú)關(guān)。與Cy5標(biāo)記的抗體相比，TF5標(biāo)記的抗體顯示出更強(qiáng)的熒光和更高的光穩(wěn)定性。這些特性使TF5成為Cy5的替代品。 

具有四跨膜蛋白抗體的經(jīng)典外來(lái)體的超凈直接免疫親和捕獲（DIC）

收集后立即將細(xì)胞條件培養(yǎng)基在4℃下分別以400× g，2,000× g和15,000× g進(jìn)行離心分離。將上清液通過(guò)0.22mm孔的PES過(guò)濾器（Millipore）過(guò)濾以產(chǎn)生預(yù)先澄清的培養(yǎng)基。隨后的所有步驟也都在4°C下進(jìn)行。如上所述，直接從人血漿中提取外來(lái)體的DIC，不同的是在這些情況下，上清液是未經(jīng)處理，未經(jīng)稀釋和未經(jīng)過(guò)濾的血漿（兩輪3000 x g產(chǎn)生離心15分鐘）。將預(yù)先清除的培養(yǎng)基分為三種方式：將一部分與直接與針對(duì)CD63，CD81或CD9的抗體綴合的磁珠一起孵育；將第二部分與綴合有小鼠IgG的磁珠一起溫育，并允許溫育并進(jìn)行章動(dòng)和旋轉(zhuǎn)16小時(shí)。將第三部分進(jìn)行超速離心和洗滌以產(chǎn)生粗制的sEV沉淀物（P120）。孵育后，將珠子在冰冷的0.1％BSA-PBS（pH 7.4，通過(guò)0.22mm膜過(guò)濾）中洗滌四次，后，在PBS pH 7.4（pH 7.4，通過(guò)0.22mm膜過(guò)濾）中洗滌一次。 ）。后一次洗滌后，立即將負(fù)載有外泌體的珠子重新懸浮在細(xì)胞裂解緩沖液和LDS樣品緩沖液中，在冰上放置30分鐘，然后重懸于LDS樣品緩沖液中，然后加熱至70°C 10分鐘以釋放蛋白質(zhì)。通過(guò)使用磁鐵從懸浮液中除去珠子，并將澄清的裂解物用于免疫印跡分析。在某些情況下，在后的洗滌步驟之后，立即將裝載了外來(lái)體的珠子裂解以提取DNA。 
（摘自：耶普森D.，菲尼克斯A.，富蘭克林J.，希金博瑟姆J.張Q.齊默曼L.利勃勒D.平J.劉Q.埃文斯R.，F(xiàn)issell，W.，Patton，J.，Rome，L.，Burnette，D.，Coffey，R.（2019）。外泌體組成細(xì)胞的重新評(píng)估177（2），428-445.e18。） 單擊此處

ExoTrap™旋轉(zhuǎn)柱

CosmoBio USA的ExoTrap™外泌體分離旋轉(zhuǎn)柱試劑盒使用旋轉(zhuǎn)柱固定的抗人CD9抗體（克隆12A12）捕獲外泌體?？梢栽?0分鐘內(nèi)從人血清，血漿，唾液，尿液和培養(yǎng)上清液中分離出外來(lái)體來(lái)源的蛋白質(zhì)和微RNA。 特征：

• 從血清，血漿，尿液，唾液，培養(yǎng)上清液中回收外泌體
• 30分鐘內(nèi)高純度外泌體
• 旋轉(zhuǎn)柱操作簡(jiǎn)單

實(shí)驗(yàn)實(shí)例 
使用ExoTrap™外泌體在50ul SDS樣品緩沖液中回收。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析外泌體標(biāo)志物表達(dá)。 圖1.從培養(yǎng)上清液中分離外來(lái)體。用抗-CD9（克隆12A12），抗-CD63（克隆8A12）和抗-CD81（克隆12C4）探測(cè)293T細(xì)胞培養(yǎng)上清液和MKN7細(xì)胞培養(yǎng)上清液（20ul /泳道）。圖2.從人血漿中分離外來(lái)體。用抗CD9（克隆12A12）探測(cè)EDTA處理的人血漿（20ul /泳道）。






 

OptiPrep™（碘克沙醇

純化外泌體的宜密度梯度培養(yǎng)基

OptiPrep™是60％碘克沙醇在水中的無(wú)菌內(nèi)毒素測(cè)試溶液，密度為1.32 g / ml。 


碘克沙醇是作為X射線造影劑開(kāi)發(fā)的，因此已經(jīng)進(jìn)行了嚴(yán)格的臨床測(cè)試。它是非離子性的，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒并且在代謝上是惰性的。碘克沙醇溶液可以在所有有用的密度下制成等滲的。碘克沙醇溶液的粘度和重量克分子滲透壓濃度低。 

Optiprep™使用高分辨率密度梯度超速離心技術(shù)進(jìn)行外來(lái)體純化

高分辨率（12％–36％）碘克沙醇密度梯度分級(jí)分離膜封閉的sEV與非囊泡（NV）組分將 OptiPrep™（碘克沙醇）密度介質(zhì)在冰冷的PBS中立即制備，然后用于產(chǎn)生不連續(xù)步驟（12 ％–36％）的漸變。將sEV的粗顆粒（P120）重懸于冰冷的PBS中，并與冰冷的碘克沙醇/ PBS混合，制成終的36％碘克沙醇溶液。將懸浮液添加到離心管的底部，將碘克沙醇濃度遞減的PBS溶液小心地鋪在頂部，產(chǎn)生完整的梯度。以相同的方式生成沒(méi)有樣品的相同梯度，以用于稍后確定餾分密度。底部負(fù)載的12％–36％梯度在120,000 x下進(jìn)行超速離心
g下使用SW41 TI擺動(dòng)鏟斗轉(zhuǎn)子（k因子124，貝克曼庫(kù)爾特）在4°C下放置15h。從梯度的頂部收集了12個(gè)1 mL的餾分。使用折射計(jì)（ATAGO，東京，日本）從重復(fù)的梯度測(cè)量分?jǐn)?shù)密度。對(duì)于納米顆粒跟蹤分析（NTA），將級(jí)分合并并在無(wú)顆粒PBS中稀釋。為了進(jìn)行免疫印跡，將每個(gè)單獨(dú)的1 mL餾分轉(zhuǎn)移到新的超速離心管中，在PBS中稀釋12倍，然后以120,000 x g的速度進(jìn)行超速離心使用SW41 TI擺動(dòng)鏟斗轉(zhuǎn)子在4°C下放置4h。將所得沉淀在冰上的細(xì)胞裂解緩沖液中裂解30分鐘。對(duì)于RNA和DNA提取，將級(jí)分合并，轉(zhuǎn)移至新的超速離心管中，在PBS中稀釋約6倍，并使用SW 32 Ti擺動(dòng)桶轉(zhuǎn)子在4°C下于120,000 x g進(jìn)行超速離心4小時(shí)。 （摘自：耶普森D.，菲尼克斯A.，富蘭克林J.，希金博瑟姆J.張Q.齊默曼L.利勃勒D.平J.劉Q.埃文斯R.，F(xiàn)issell，W.，Patton，J.，Rome，L.，Burnette，D.，Coffey，R.（2019）。外泌體組成細(xì)胞的重新評(píng)估177（2），428-445.e18。）

Optiprep™應(yīng)用說(shuō)明

1. 條件培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞外泌體和其他微泡
2. 來(lái)自非哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞外囊泡
3. 細(xì)胞內(nèi)外囊泡運(yùn)輸和囊外復(fù)合物-方法學(xué)概述
4. 制備突觸小體，突觸小體，神經(jīng)黑色素顆粒和突觸小泡–方法學(xué)調(diào)查
5. 從各種來(lái)源分離水泡和顆粒部分

用戶報(bào)告

四跨素抗體

西田青樹（Nao Nishida-Aoki） 
國(guó)家癌癥中心分子與細(xì)胞治療研究所

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

外泌體是脂質(zhì)雙層限定的直徑約100nm的囊泡。癌細(xì)胞通過(guò)分泌促進(jìn)癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的外來(lái)體，對(duì)周圍細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。我們想知道抑制癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體功能是否會(huì)抑制癌癥轉(zhuǎn)移。為此，我們使用了與外泌體結(jié)合的抗體來(lái)抑制源自癌細(xì)胞的外泌體的作用。

尋找能識(shí)別人乳腺癌細(xì)胞外來(lái)體的抗體用于具有人乳腺癌細(xì)胞的小鼠異種移植模型。首先，我們要檢查抗人CD9和抗人CD63是否會(huì)結(jié)合到從乳腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基分離的外泌體表面。外泌體的小尺寸阻止了常規(guī)顯微鏡的使用。因此，有必要采用免疫電子顯微鏡。但是，免疫電子顯微鏡具有挑戰(zhàn)性，需要與靶標(biāo)結(jié)合良好的抗體。

抗人CD9（克隆12A12）和抗人CD63（克隆8A12）在免疫沉淀方面具有良好的記錄，因此有望在免疫電子顯微鏡中進(jìn)行測(cè)試。這些試劑很容易檢測(cè)到CD63。但是，檢測(cè)CD9之前，需要進(jìn)行實(shí)質(zhì)性修改，才能成功染色（圖1）。另外，出于該實(shí)驗(yàn)的目的，重要的是所選抗體對(duì)人類而非小鼠具有*的特異性，以防止毒性和脫靶效應(yīng)。在蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該抗體具有非常強(qiáng)的人特異性，可以輕松檢測(cè)到來(lái)自人而非小鼠的CD9和CD63（圖2）。

建立了兩種抗體的檢測(cè)方案和人類特異性后，有可能進(jìn)行體內(nèi)研究。在乳腺癌的鼠異種移植模型中施用抗人CD9（克隆12A12）和抗人CD63（克隆8A12），以確定是否有可能抑制轉(zhuǎn)移。在此模型中，我們能夠成功抑制癌癥轉(zhuǎn)移（參考文獻(xiàn)1）。我們認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)的成功*歸因于我們使用的高質(zhì)量抗體。我希望這些抗體能夠幫助更多的人進(jìn)行研究。

數(shù)字

圖1.免疫電子顯微鏡檢測(cè)外泌體表面上的人CD9和CD63蛋白 
（A）抗人CD9抗體（克隆12A12）在人乳腺癌細(xì)胞的外泌體表面上檢測(cè)到CD9。（B）抗人CD63抗體（克隆8A12）還在人乳腺癌細(xì)胞的外泌體表面檢測(cè)到CD63。 圖2.人類和小鼠CD9和CD63蛋白的蛋白質(zhì)印跡法使用 抗人類CD9抗體（克隆12A12），抗人類CD63抗體（克隆8A12），抗小鼠CD9抗體和抗小鼠CD63抗體來(lái)探測(cè)含有來(lái)自人乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231-lucD3H2LN）和鼠類乳腺癌細(xì)胞系（4T1-luc）的裂解物。

參考文獻(xiàn)

1. 西田青木（Nishida-Aoki，N.），富永（N. Tominaga），竹下（F.Takeshita），園田H. （2017）循環(huán)中的細(xì)胞外囊泡破壞作為一種針對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移的新型治療策略，Mol Ther，25：181-91。

小坂伸吉國(guó)立 
癌中心
分子細(xì)胞治療研究所

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

外泌體是直徑約100 nm的小細(xì)胞外分泌脂質(zhì)雙層分隔的囊泡。ISEV（細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)）建議使用術(shù)語(yǔ)細(xì)胞外囊泡（EVs）來(lái)指代分泌性囊泡的異質(zhì)類，其中包括衍生自多囊泡內(nèi)體的囊泡。近的外泌體研究已經(jīng)開(kāi)始闡明外泌體在某些疾病中的作用。但是，要了解外泌體的產(chǎn)生機(jī)理，必須具有：1）生理學(xué)上了解外泌體的作用；2）了解外泌體引起的疾病。闡明癌細(xì)胞外泌體分泌的機(jī)制可能導(dǎo)致新的癌癥治療方法。

為了追蹤外泌體產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)，我們使用抗人CD63抗體（克隆8A12；可從Cosmo Bio USA獲得）進(jìn)行免疫染色實(shí)驗(yàn)。使用免疫熒光顯微鏡，我們?cè)谇傲邢侔┘?xì)胞系PC-3M（圖1）和結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116（圖2）中觀察到許多CD63陽(yáng)性顆粒樣結(jié)構(gòu)。將來(lái)，我們將癌細(xì)胞與抗人CD63抗體（克隆8A12）和其他內(nèi)體標(biāo)記物抗體共同染色，以探索癌細(xì)胞產(chǎn)生外泌體的能力?？谷薈D63抗體（克隆8A12）的高特異性使其可以成功用于體內(nèi)靶向外泌體以抑制癌癥轉(zhuǎn)移。

數(shù)字

圖1. CD63在前列腺癌細(xì)胞系PC-3M中的 
定位通過(guò)Alexa Fluor™488標(biāo)記的抗小鼠二抗檢測(cè)到抗人CD63抗體（克隆8A12）。 圖2. CD63在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中的定位通過(guò)Alexa Fluor™488標(biāo)記的抗小鼠二抗檢測(cè)到抗人CD63抗體（克隆8A12）



 

吉岡雄介 
國(guó)立癌癥中心研究所

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

1975年，喬治·科勒（George Kohler）和塞薩爾·米爾斯坦（CésarMilstein）發(fā)明了單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)，并因此在1984年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。單克隆抗體*改變了制藥業(yè)，為新型診斷和靶向療法打開(kāi)了大門。它不僅有益于醫(yī)學(xué)實(shí)踐，也有益于基礎(chǔ)研究。并非所有的單克隆抗體都等效。對(duì)于每種特定的應(yīng)用，識(shí)別“好”抗體很重要。通常，“好”抗體是識(shí)別單個(gè)分子并與其分子靶標(biāo)牢固結(jié)合的抗體。

在外泌體研究中獲得“良好抗體”尤為重要。外泌體是脂質(zhì)雙層分隔的囊泡，直徑約100 nm，在其管腔和膜中含有各種蛋白質(zhì)。使用免疫電子顯微鏡，免疫印跡，ELISA，免疫沉淀和免疫親和柱，已使用抗體來(lái)檢測(cè)和分離體液或培養(yǎng)上清液中的外泌體。這些應(yīng)用需要“優(yōu)質(zhì)”抗體。

由于外泌體是異質(zhì)的，因此根據(jù)其來(lái)源，它們可能會(huì)展示并包含不同的分子。但是，蛋白質(zhì)的一個(gè)子集很可能在不同類型的外泌體之間共享。目前，好的泛外泌體標(biāo)記是四跨膜蛋白CD9，CD63和CD81。我的外泌體研究始于構(gòu)建外泌體檢測(cè)系統(tǒng)的目標(biāo)。我努力尋找在我的檢測(cè)系統(tǒng)中識(shí)別外泌體標(biāo)記的單克隆抗體。盡管我嘗試了許多克隆，但直到發(fā)現(xiàn)抗CD9（克隆12A12）和抗CD63（克隆8A12）（圖1和參考2），我都沒(méi)有獲得好的結(jié)果。這些抗體在蛋白質(zhì)印跡（圖2）和免疫電子顯微鏡中表現(xiàn)良好。這些抗體的人類特異性由其無(wú)法檢測(cè)小鼠CD9和小鼠CD63證實(shí)。該特性在小鼠的人異種移植模型系統(tǒng)中很有用，在這種系統(tǒng)中，抗體不會(huì)與內(nèi)源性CD9和CD63反應(yīng)。如果在檢測(cè)人外泌體時(shí)遇到問(wèn)題，則抗CD9（克隆12A12）和抗CD63（克隆8A12）抗體可能會(huì)有用。

數(shù)字

圖1.克隆12A12（抗CD9）和8A12（抗CD63）相對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手克隆A和B的ELISA性能。 圖2.克隆8A12（抗CD63）和12A12（抗CD9）的免疫印跡性能人類外泌體。

參考文獻(xiàn)

1. 吉岡Y等。（2013）J Extracell Vesicles ，2：20424
2. 吉岡Y等。（2014）Nat Commun，5：3591

高橋彰子 
癌癥研究基金會(huì)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

外來(lái)體通過(guò)ESCRT復(fù)合物的作用從多囊泡內(nèi)體中包含的囊泡中產(chǎn)生。這些腔內(nèi)囊泡被分泌為直徑為50-150nm的細(xì)胞外囊泡。近來(lái)，隨著外泌體包含蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和核酸的發(fā)現(xiàn)，許多注意力集中在它們作為細(xì)胞間通訊載體的功能上。

我們正在分析衰老相關(guān)的分泌表型，其部分特征是炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的分泌增加。衰老細(xì)胞還提高了外泌體的分泌（參考文獻(xiàn)1）。我們通過(guò)正常人成纖維細(xì)胞的連續(xù)傳代（復(fù)制性衰老）和引入激活的癌基因RasV12（癌基因誘導(dǎo)的衰老）來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。溫育48小時(shí)后，通過(guò)超速離心回收條件培養(yǎng)基中的外來(lái)體。回收的細(xì)胞外物質(zhì)的大小分布通過(guò)納米顆粒跟蹤分析進(jìn)行表征。衰老細(xì)胞中分泌的外泌體的數(shù)量是年輕細(xì)胞的30??至50倍（圖1，頂部）。為了進(jìn)一步比較衰老與年輕外來(lái)體，我們使用抗人CD81單克隆抗體（克隆12C4，以1：1000稀釋度使用；來(lái)自Cosmo Bio USA）進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，從衰老中回收的CD81蛋白量相對(duì)于年輕外來(lái)體有所增加（圖1，底部）。還觀察到從衰老細(xì)胞中回收的外泌體對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞具有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用（參考文獻(xiàn)2）。

外泌體的生理作用和診斷/治療潛力仍未*了解。我們正在分析正常細(xì)胞和衰老細(xì)胞分泌外泌體的詳細(xì)分子機(jī)制，以期闡明外泌體的生物學(xué)意義。此外，通過(guò)研究衰老 

數(shù)字

人類成纖維細(xì)胞TIG-3細(xì)胞年輕和衰老版本的外泌體分析（來(lái)自參考文獻(xiàn)1）。
上圖：通過(guò)NTA（納米粒子跟蹤分析）確定的回收的外泌體的相對(duì)數(shù)量。下圖：外泌體標(biāo)記蛋白的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

1. Takahashi，A.等。外泌體通過(guò)從細(xì)胞中排出有害DNA來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。納特COMMUN 8，15287（2017）。
2. 高杉，M。等。衰老細(xì)胞分泌的小細(xì)胞外囊泡通過(guò)EphA2促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。納特COMMUN 8，15729（2017）

EXOTRAP™外來(lái)體分離離心柱套件

名古屋大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科
病毒學(xué)
研究科佐藤佳隆

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

外泌體是膜包裹的30至100 nm的囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)和核酸，并由各種細(xì)胞分泌。通過(guò)獲取循環(huán)的通路，它們可以將信號(hào)傳輸?shù)竭h(yuǎn)處的小區(qū)。已經(jīng)觀察到，通過(guò)外來(lái)體的細(xì)胞間通訊與抗原呈遞，細(xì)胞凋亡，炎癥，腫瘤進(jìn)展和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。預(yù)計(jì)外泌體將在各個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，例如在藥物輸送系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)中。

我們對(duì)病毒感染的細(xì)胞與附近未感染的細(xì)胞之間的相互作用感興趣。當(dāng)病毒感染的細(xì)胞與未感染的細(xì)胞混合培養(yǎng)后，熒光免疫染色可以檢測(cè)未感染細(xì)胞中的病毒蛋白，呈點(diǎn)狀信號(hào)。從這個(gè)發(fā)現(xiàn)，我對(duì)作為細(xì)胞間通訊介體的外泌體產(chǎn)生了興趣。

由于涉及冗長(zhǎng)而困難的方法（傳統(tǒng)上包括超速離心），因此比較從各種來(lái)源和在不同條件下回收的外泌體具有挑戰(zhàn)性。因此，從操作簡(jiǎn)便（任何人都可以純化），純化時(shí)間（可以在短時(shí)間內(nèi)完成純化）和應(yīng)用的多功能性（可以分析外泌體本身以及所含蛋白質(zhì)和核酸）的角度出發(fā)，我們進(jìn)行了商業(yè)化探索可用的外泌體純化試劑盒，發(fā)現(xiàn)CosmoBio USA的“ ExoTrap™外泌體分離旋轉(zhuǎn)柱試劑盒”是理想的純化解決方案。

ExoTrap™的優(yōu)勢(shì)在于，可以在僅30分鐘的“短時(shí)間內(nèi)”從少量樣品中純化外泌體。作為外泌體研究的初學(xué)者，ExoTrap™使我能夠通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)與在純化前培養(yǎng)上清液中無(wú)法檢測(cè)到的外泌體相關(guān)的病毒蛋白。而且，我能夠證明在從外泌體抑制劑（GW4869）處理過(guò)的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中回收的ExoTrap™純化的外泌體中未檢測(cè)到病毒蛋白（1）。盡管ExoTrap™可能不適合廉價(jià)地純化大量外泌體，但強(qiáng)烈建議從小體積快速簡(jiǎn)便地純化外泌體。 

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圖1.外泌體純化之前和之后以及用外泌體抑制劑處理之前和之后的
Western印跡（A）Western印跡顯示“ ExoTrap™外泌體分離旋轉(zhuǎn)柱試劑盒”純化的外泌體中LMP1和Hsp70的表達(dá)。
（B）Western印跡顯示“ ExoTrap™外來(lái)體分離旋轉(zhuǎn)柱試劑盒”純化的外來(lái)體中LMP1和Hsp70的表達(dá)，這些細(xì)胞來(lái)自用或未用外來(lái)體抑制劑（GW4869）處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

參考文獻(xiàn)

1. Sato et al。，Oncotarget，8; 39345-39355、2017年

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