agilent 210518說明書

agilent 210518即Stratagene 210518

QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit

Instruction Manual Catalog # 210518 (10 reactions) and #210519 (30 reactions) Revision F.0

uikchange閃電現(xiàn)場定向誘變試劑盒

Quikchange閃電現(xiàn)場定向誘變試劑盒
提供的材料

Quikchange Lightning Site定向誘變試劑盒（目錄210518）含有足夠的試劑，總共10種。
反應，包括2個控制反應。
b Quikchange Lightning Site定向誘變試劑盒（目錄210519）含有足夠30種試劑。
反應，包括2個控制反應。
c將dntp混合物解凍一次，制備一次性小份，并將小份儲存在-20°C下。不要對dntp混合物進行處理。
多次凍融循環(huán)。d dntp混合物和dpn i酶的成分是專有的。這些試劑已針對
quikchange-lightning協(xié)議，并已獲得與其他套件組件一起使用的資格。不
用其他安捷倫試劑盒或其他來源的dntp混合物或dpn i酶制劑替代。
E基因型：tetr
?（mcra）183?（mcrcb hsdsmr mrr）173 enda1 supe44 thi-1 reca1 gyra96 rela1 lac hte
【F’Proab Laci】
Q
Z?M15 tn10（太特
Amy Camr
]
f見介質和試劑的制備。
儲存條件
XL10金超能干細胞、XL10金β-Me和PUC18控制質粒：–80°C
所有其他部件：–20°C
所需附加材料
14毫升bd falcon聚丙烯圓底管（bd biosciences目錄）
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃甙（x-gal）
異丙基-1-硫-β-d-半乳吡喃苷（IPTG）

買方通知
本產品的使用是根據(jù)以下美國專有技術號57891665932419中的一個或多個獲得許可的，
6391548、6713285、7132265和7176004。
本產品是根據(jù)Bio-Rad實驗室和安捷倫技術公司之間的協(xié)議提供的。
本產品的制造、使用、銷售或進口均以我方為準。拍打。編號6627424和EP
拍打。Bio-Rad Laboratories，Inc.所有的1 283 875 B1號。購買本產品后將
買方不可轉讓使用購買的產品和部件的權利。
研究領域的PCR產品（但不是實時PCR），包括所有應用研究領域
（包括但不限于動物試驗和食品試驗）。

介紹
Quikchange Lightning站點定向誘變套件*提供突變
質粒比我們原來的QuikChange試劑盒快三倍
誘變效率或準確性的損失。該套件已針對
高達14kb質粒的誘變，允許快速、和
用單一試劑盒誘變大小質粒。使用
先進的高保真酶技術，協(xié)議
加速，同時保持高的現(xiàn)場指導精度
誘變。QuikChange Lightning網站
誘變試劑盒是一種專有技術的基于pfu的聚合酶混合物。
優(yōu)化的dpn i酶，它們一起允許在
大約一個小時，加上一夜之間的轉變。

圖1 Quikchange閃電現(xiàn)場定向誘變方法概述。

美國專有技術號7176004；7132265；6734293；6444428；6391548；6183997；
5948663、5932419和5789166。
六
體外定向誘變是一種非常有價值的技術
描述蛋白質結構之間的動態(tài)、復雜關系
和功能，用于研究基因表達元件，以及執(zhí)行
矢量修改。這種技術的幾種方法
但這些方法通常需要單鏈DNA
（SSDNA）作為模板1–4
勞動密集型或技術難度大。
我們的QuikChange Lightning站點定向誘變套件允許站點特定
幾乎所有雙鏈質粒的突變，從而消除
亞克隆和SSDNA救援的需求。5
此外，QuikChange
閃電現(xiàn)場定向誘變試劑盒不需要專門的
載體，*的限制位點，多重轉化或體外
甲基化處理步驟。簡單、快速的三步程序需要
僅在轉化前1小時（對于小于等于5 kb的質粒），以及
在單一反應中產生效率大于85%的突變體（參見
圖1）。
Quikchange閃電酶是一種新型的專有技術混合物
包括pfuultra高保真（hf）DNA聚合酶**的衍生物
兩條質粒鏈的誘變引物定向復制
高保真度。所有的基本程序都采用了超螺旋雙絞線。
一個感興趣的插入物和兩個合成物的DNA（dsdna）載體
寡核苷酸引物，均含有所需的突變（見圖1）。
寡核苷酸引物，每個引物與
載體，在溫度循環(huán)過程中被pfuultra-hf-dna擴展。
聚合酶，無底物置換。寡核苷酸的延伸
引物產生含有交錯缺口的突變質粒。跟隨
溫度循環(huán)，產品經DPN I處理。
內切酶（靶序列：5´-GM6ATC-3´）對甲基化有特異性。
半甲基化DNA，用于消化親本DNA模板
并選擇含有合成DNA的突變。6（DNA分離
幾乎所有的大腸桿菌菌株都是DAM甲基化的，因此對
含有所需突變的刻痕載體DNA。
然后轉化為XL10金超能力細胞。
注意，質粒DNA從幾乎所有常用的
大腸桿菌菌株（DAM+）是甲基化的，是
突變，質粒DNA從特殊的DAM中分離出來-
包括JM110和SCS110在內的大腸桿菌菌株不適用。
不需要的第二位點錯誤幾乎被消除，高突變
由于該方法的高保真度，
pfuultra-hf-dna聚合酶，使用少量起始dna
模板和使用的熱循環(huán)次數(shù)少。
QuikChange Lightning Site定向誘變試劑盒可用于
點突變，替換氨基酸，刪除或插入單個或
多種相鄰氨基酸。該試劑盒已用質粒進行了優(yōu)化。
大小從4到14 KB不等。

* NOS的美國專有技術。6734293 6444428 6183997和5948663；；；。DNA聚合酶有HF會pfuultra 18倍比Taq DNA合成的高逼真度
DNA聚合酶。
7
控制quikchange閃電誘變
在pwhitescript 4.5-kb控制質粒是用來測試的效率
代突變質粒使用網站定向quikchange閃電
誘變試劑盒。在pwhitescript 4.5-kb質粒包含停止控制
密碼子TAA密碼子谷氨酰胺在位置（CAA）的其中一個
通常出現(xiàn)在β-半乳糖苷酶基因的質粒pBluescript II SK（-）
噬菌粒（9相應到氨基酸的蛋白質）。xl10金
ultracompetent細胞轉化質粒與本控制上出現(xiàn)白色
lb–ampicillin瓊脂板（湖的制備和研究——媒體）
含有IPTG和X-gal，因為β-半乳糖苷酶的活動。
obliterated。創(chuàng)建一個寡核苷酸控制點突變在primers
一個reverts pwhitescript 4.5-kb控制質粒的T殘留的停止
在密碼子的氨基酸（TAA）的β-半乳糖苷酶基因的9個殘基的C，
生產的谷氨酰胺密碼子（CAA）發(fā)現(xiàn)野生型序列。
以下screened殖民地可以轉化為β-半乳糖苷酶
（β-半乳糖+）表型的媒體上的藍色的顏色含有IPTG和X-gal染色。

底漆設計指南
本方案中使用的致突變寡核苷酸引物必須是
根據(jù)所需的突變單獨設計。以下
設計誘變引物時應考慮：
♦兩個誘變引物都必須包含所需的誘變和
在質粒的相反鏈上退火到相同的序列。
♦底漆的長度應在25至45個底座之間，并熔化。
溫度（tm）≥78°C?？墒褂瞄L度超過45個堿基的底漆，
但使用較長的引物會增加二次結構的可能性。
從而影響誘變反應的效率。
下列公式通常用于估算
引物：Tm = 81.5 + 0.41(%GC) − (675/N) − % mismatch
計算tm時：

•n是底材中的底漆長度
•%gc和%mismatch的值是整數(shù)
用于計算用于引入插入或
刪除，使用上述公式的修改版本：
81.5+0.41%（gc）（675/）tm=−n
其中n不包括插入或刪除的基

所需的突變（缺失或插入）應在
底漆兩邊各有大約10-15個正確順序的底座。
♦底漆的低GC含量應為40%，并且
應以一個或多個C或G基終止。
♦引物不需要5´磷酸化。
tm=81.5+0.41%（gc）−（675/n）−不匹配百分比
九
♦對于典型的誘變引物，脫鹽純化通常是
足夠的。對于長的或復雜的誘變引物，純化
液相色譜法（PLAC/FPLC）或聚丙烯酰胺凝膠
電泳（PAGE）可顯著增加
誘變效率。
其他底漆注意事項
♦誘變方案使用每個寡核苷酸引物125 ng。
要將納克轉化為低聚物的皮摩爾，請使用以下方法
方程式：

保持底漆濃度過高很重要。我們建議
改變模板量，同時保持
底漆經常過量。
 協(xié)議
突變鏈合成反應（熱循環(huán)）
注意確保質粒DNA模板從DAM中分離出來。+
大腸桿菌菌株。大多數(shù)常用的大腸桿菌菌株
是大壩+。從DAM菌株（如JM110）分離出質粒DNA
SCS110）不適用。
為了大限度地提高溫度循環(huán)性能，我們
建議使用薄壁管，確保理想接觸
溫度循環(huán)器的熱阻。以下協(xié)議
使用薄壁管進行優(yōu)化。
1。合成兩個包含所需的
突變，兩側是未修改的核苷酸序列。凈化這些
在以下步驟中使用前的寡核苷酸引物（參見
誘變引物設計）。
2。準備控制反應如下：
5微升10×反應緩沖液
pwHitescript 4.5-kb控制質粒5μl（25 ng）（5 ng/μl）
1.25微升（125 ng）寡核苷酸對照引物1
[34摩爾（100 ng/微升）]
1.25微升（125 ng）寡核苷酸對照引物2
[34摩爾（100 ng/微升）]
1微升dntp混合物
1.5微升液體試劑
34微升DDH2O（使終反應體積達到50微升）
然后添加：
1微升Quikchange閃電酶
三。制備樣品反應，如下所示：
注：使用不同數(shù)量的
dsdna模板范圍從10到100 ng（例如，10，25，50，
和100 ng dsdna模板）同時保持引物
濃度常數(shù)。
5微升10×反應緩沖液
dsdna模板的xμl（10–100 ng）
寡核苷酸引物的xμl（125 ng）1
寡核苷酸引物的xμl（125 ng）2
1微升dntp混合物
1.5微升液體試劑
DDH2O，終體積為50μl

然后添加：
1微升Quikchange閃電酶
十一
4。使用表1中列出的循環(huán)參數(shù)循環(huán)每個反應。
（對于控制反應，延長2.5分鐘。）
表一
定向QuikChange閃電場地的循環(huán)參數(shù)
誘變方法

例如，5-kb質粒在68°C條件下每個周期需要2.5分鐘。

DPN I放大產物的消化
1。直接將2微升提供的DPN I限制酶添加到每個
放大反應。
注：僅使用所提供的DPN I酶；不得用
另一種來源的酶。
2。輕輕和*地混合每個反應混合物
上下解決方案多次。簡單地降低反應速度
混合物，然后立即在37°C下培養(yǎng)5分鐘以消化。
親本（即非突變的）超壓縮dsdna。
XL10金超能力細胞的轉化
注意：在繼續(xù)之前，請閱讀轉換指南。
轉換協(xié)議。
XL10金細胞對四環(huán)素和
氯霉素。如果突變質粒只含有tetr
或抗camr標記，一種有能力細胞的替代品系。
必須使用。
1。在冰上輕輕融化XL10金超能力細胞。對于每一個
待轉化的對照反應和樣品反應，等分45微升
14 ml bd falcon聚丙烯的超能力細胞
圓底管。
2。將隨試劑盒提供的2μlβ-Me混合物添加到45μl的
細胞。（使用β-Me的替代來源可能會減少轉化
效率。
三。輕輕地旋轉管中的內容物。在冰上培養(yǎng)細胞
2分鐘。

4。從每個對照品和樣品中轉移2微升經dpn i處理的DNA。
對分離部分超能力細胞的反應。
作為可選控制，驗證
通過添加1微升0.01 ng/微升puc18的XL10金超能力細胞
對照質粒（在水中稀釋1:10的對照品）
另一個45-微升的小份細胞。
5。輕輕旋轉轉化反應，混合和培養(yǎng)
冰上反應30分鐘。
注：此步驟的培養(yǎng)時間可縮短至
10分鐘，轉換過程中無重大損失
效率。
6。在A中預熱NZY+肉湯（見介質和試劑的制備）
步驟9中使用的42°C水浴。
注：XL10金超能力細胞的轉化
使用NZY+肉湯優(yōu)化。
7。在42°C水浴中加熱脈沖管30秒。持續(xù)時間
熱脈沖對獲得率至關重要。做
不超過42°C。
注：該熱脈沖已優(yōu)化用于
14毫升bd falcon聚丙烯圓底管。
8。在冰上孵育試管2分鐘。
9。向每個試管中加入0.5毫升預熱（42°C）NZY+肉湯，然后孵化。
管道在37°C下振動1小時，轉速為225–250轉/分。
十三
10。將每個轉化反應的適當體積，如
下表所示，在含有適當
質粒載體的抗生素。
對于誘變和轉化控制，將細胞傳到
LB-氨芐西林瓊脂平板，含80μg/ml x-gal和20 mm IPTG
（參見準備用于彩色篩選的瓊脂板）。
轉化反應電鍍量

當電鍍體積小于100μl時，在
瓊脂平板，用移液管將小體積的轉化反應移入池中，然后
攤鋪混合物。
B撒布量根據(jù)
誘變質粒。通常對整個變換混合物進行電鍍是有用的，
分為多個板，覆蓋一系列電鍍體積。
11。將轉化板在37°C下培養(yǎng)16小時以上。
控件轉換的預期結果
pwhitescript轉換后的預期菌落數(shù)
4.5kb對照誘變反應>100個菌落。大于85%
菌落應含有突變，并在瓊脂上呈藍色菌落。
含有IPTG和X-Gal的板。
注意pwitescript 4.5-kb的誘變效率（Me）
對照質粒的計算公式如下：

如果對puc18控制質粒進行轉化，
>應觀察到50個菌落（>109 cfu/μg），其中>98%的菌落具有
藍色表型。
樣本轉換的預期結果
預期菌落數(shù)取決于基組分和長度。
使用的DNA模板。關于增加殖民地的建議
編號，請參閱故障排除。插入感興趣的內容應排序為
驗證所選克隆是否包含所需的突變。

轉型指導方針
儲存條件
超能力細胞對溫度的微小變化很敏感。
必須存放在-80°C冰箱的底部。從傳輸管道
一個冷凍室到另一個冷凍室可能會導致效率下降。超級電容器
電池應直接從干冰運輸容器放置在-80°C。
對齊單元格
配藥時，應始終將超能力細胞放在冰上。這是必要的。
把bd falcon聚丙烯管放在電池前的冰上
解凍后，細胞被直接分配到預成丘的試管中。
14毫升bd falcon聚丙烯圓底管的使用
重要的是14毫升bd falcon聚丙烯圓底管
（BD Biosciences Catalog_）用于轉換協(xié)議，
因為其他試管可能會被β-巰基乙醇降解
轉換協(xié)議。此外，熱脈沖步驟的持續(xù)時間為
關鍵，并針對厚度和形狀進行了專門優(yōu)化
這些管子。
β-巰基乙醇的使用
β-巰基乙醇（β-Me）可以增加轉化率。
效率。該試劑盒中提供的XL10金β-巰基乙醇混合物是
稀釋后即可使用。
添加的DNA數(shù)量
當添加2μl合成物時，觀察到大效率。
反應。當添加一個
盡管總效率可能
低一些。
熱脈沖的長度和溫度
有一個由熱量產生的效率高的限定窗口。
轉換過程中的脈沖。在細胞中觀察到效率。
熱脈沖30秒。不得超過42°C。
彩色篩選用瓊脂板的制備
準備用于藍白篩選的LB瓊脂平板，添加80μg/ml。
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃甙（x-gal），20 mm
異丙基-1-硫-β-d-半乳吡喃苷（IPTG），以及適當?shù)?br />LB瓊脂的抗生素。或者，100μl的10 mm IPTG和100μl
2%的x-gal可以在電鍍前30分鐘在LB瓊脂板上涂抹。
轉變。用無菌的DH2O制備IPTG；用
二甲基甲酰胺（DMF）。之前不要混合IPTG和X-GAL
用移液管把它們移到盤子上，因為這些化學物質會沉淀。

故障排除
當根據(jù)本說明手冊中概述的指南使用時，此套件提供可靠的
使用dsdna模板進行定點突變的方法?；A成分的變化
DNA模板的長度和熱循環(huán)性能可能導致
誘變效率。